Saggio tunel - istologia

Scritto da Dott. Crisafulli F..
Pubblicato il 26-07-2014 Revisionato il 01-02-2017
Dott. Crisafulli F.

Laureato in biologia, curo da oltre quindici anni siti di informazione scientifica.

Il saggio tunel è un metodo attraverso il quale è possibile rlevare la presenza di DNA frammentato. Per questo motivo, il saggio tunel, è di elezione quando - nell'ambito di una indagine citoistochimica o diagnostica - si ricercano gli eventi di apoptosi cellulare. Nel processo apoptotico, difatti, le endonucleasi digeriscono il DNA, producendo numerosi frammenti con estremità 3'-OH libere.

Nel saggio tunel si utilizza un enzima coinvolto nel mantenimento della lunghezza dei telomeri chimato terminal transferasi, capace di agganciare le estremità 3'-OH libere e aggiungere, in progressione, dei nucleotidi. La tecnica tunel è una delle cosiddette tecniche in situ poiché viene effettuata direttamente nel tessuto.

Meccanismo

Il tessuto è dapprima lavorato per la sua fissazione e, successivamente, è accuratamente lavato. La permeabilizzazione delle cellule è necessaria poiché, in questo modo, è possibile porre il tessuto in una soluzione contenente i deossioligonucleotidi marcati - solitamente dUTP - e la terminal transferasi.

Metodo diretto

Nel metodo diretto l'UTP è marcato con un fluorocromo, ad esempio è molto utilizzato l'isotiocianato di fluoresceina. L'utilizzo di un microscopio a fluorescenza permette di evidenziare la radiazione emessa dalla fluoresceina e discriminare, in questo modo, le cellule apoptotiche da quelle non apoptotiche.

Metodo indiretto

Il metodo indiretto, prevede l'utilizzo di deossioligonucleotidi non marcati ma coniugati con l'avidina. In questo modo, si formano dei complessi DNA-catene di oligonucleotidi con avidina, che possono essere legati dalla biotina che, infine, può servire da substrato per la colorazione attraverso perossidasi.

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