Una libreria genomica rappresenta una collezione completa di acidi nucleici rappresentativi di un intero organismo. Attraverso una libreria genomica è possibile preservare, per fini più diversi, il genoma di organismi molto semplici oppure di organismi complessi.
Una libreria genomica è formata da più cloni, ineseriti in appositi vettori, che contengono, ciascuno di essi, un frammento del genoma originario. La scelta dei vettori è legata ad alcuni fattori, tra cui la larghezza - in termini di paia di basi - del genoma dell'organismo.
La creazione di una libreria genomica è una operazione molto complessa, che prevede una serie di step e di protocolli. Nonostante la difficoltà, le librerie genomiche rappresentano uno strumento fondamentale per la moderna ricerca.
Caratteristiche di una libreria genomica
Una libreria genomica, affinché possa considerarsi valida, deve possedere alcune caratteristiche: deve essere rappresentativa e ridondante. La rappresentatività di una libreria genomica è data dalla presenza, in almeno una copia, di ogni frammento del genoma. Se così non fosse, ad esempio se la libreria genomica non avesse tutte le parti del corredo genetico dell'organismo, dal punto di vista sperimentale potrebbe essere inutilizzabile poiché potrebbe mancare di importanti geni, o genericamente di sequenze di DNA. La mancanza di un frammento, inoltre, potrebbe rendere difficile o impossibile la ricostruzione intera del genoma di partenza.
La ridondanza è una caratteristica intrinseca delle librerie genomiche e indica la presenza, in più copie, di frammenti genomici. La presenza di più copie è "fisiologica" e deriva dal tipo di procedura necessario per creare i cloni.
Creazione di una libreria genomica
La creazione di una libreria genomica è un processo molto articolato che prevede la realizzazione, in sequenza, di alcuni step di selezione, di verifica e di conservazione.
Frammentazione del DNA
La frammentazione del DNA può essere di tipo meccanico o enzimatico. Attraverso la frammentazione meccanica, operata attraverso la compressione fisica o la nebulizzazione capillare, si produce un DNA con delle estremità piatte. La presenza di queste estremità non è compatibile con una futura operazione di assemblaggio, per questo motivo si utilizzano degli adattatori che rendono le estremità del DNA compatibili per i processi di futuro assemblaggio. La rottura enzimatica avviene grazie all'utilizzo di un enzima di restrizione che riconosce delle specifiche sequenze nel DNA e, a livello di esse, opera una taglio sfalsato.
Allestimento dei vettori
La scelta dei vettori è un passo di fondamentale importanza per la corretta costruzione della libreria genomica. Il limite tecnico del vettore è determinato dalla capacità, in termini di paia di basi, di contenimento. In sintesi, esistono due tipi di vettore: plasmidico e fagico. Un plasmide è un elemento extracromosomico a doppia elica, strutturalmente circolarizzato spesso in grado di spostarsi in modo autonomo da cellula a cellula. Un fago è un virus che infetta un batterio. Appare subito chiaro che un fago è strutturalmente più complesso di un plasmide, e pertanto necessita di essere ingegnerizzato in modo differente. Una differenza, importante per la costruzione della libreria genomica, è data dalla capacità di contenere materiale genetico. I plasmidi, possono contenere circa 4kbp mentre i fagi, specialmente queli ingegnerizzati possono contenere anche 300Kbp.
Per la clonazione e la creazione di piccoli genomi la scelta del plasmide può essere ideale poiché con poche decine di vettori si può ottenere una rappresentatività della libreria. Genomi più grandi, come quelli eucariotici, necessitano di altri vettori, spesso presenti in numero vicino alle centinaia o alle migliaia.
L'inserimento di DNA esogeno, in un ospite, mediante un plasmide avviene mediante un sistema chimico o fisico che permette alla membrana di far passare il plasmide. Per la costruzione di una libreria fagica, è necessario ricreare artificialmente il sistema del virus, definito genericamente package.
Numero di cloni indipendenti
Per valutare la rappresentatività di una libreria si può calcolare un parametro statistico, chiamato numero di cloni indipendenti (IN). In sintesi, la conoscenza del numero di cloni indipendenti da un'idea del numero di cloni necessario per avere unabuona probabilità di ottenere una rappresentatività della libreria.
Screening di una libreria
Lo screening di una libreria è un procedimento attraverso il quale è possibile determinare se una colonia è ricombinante e se, di conseguenza, possiede il frammento genico di interesse. Vista la complessità della creazione di una libreria, e dei cloni in essa presenti, è possibile che una colonia non abbia ricevuto il frammento di DNA del genoma e quindi non sia utilie ai fini della creazione della libreria.
Screening primario
Dopo aver clonato il genoma, si effettua uno screening primario che serve a stabilire quale delle colonie, generalmente presenti in una capsula Petri, ha effettivamente ricevuto il frammento di DNA. Per fare questo si appoggia un filtro che, in poco tempo, assorbirà parte della colonia. Il filtro viene, successivamente trattato per esporre il DNA, attraverso una reazione basica con idrossido di sodio. Il filtro, a questo punto, contiene colonie ricombinanti e colonie originarie; per valutare questa condizione si usa una sonda marcata, complementare per una piccola porzione di DNA del genoma di interesse, e si osserva quale delle colonie risponde alla sonda. Il rilevamento della colonia sul filtro determina, direttamente, la posizione della colonia nella capsula di petri che possiede gli elementi con il DNA esogeno.
Screening secondario
Lo screening secondario affianca lo screening primario e permette l'isolamento delle colonie effettivamente in possesso del DNA di interesse, dalle colonie che pure essendo presenti nello stesso "spazio" dello screening primario, non presentano il DNA esogeno.
Conservazione delle colonie
In base al tipo di protocollo, le colonie possono essere conservate in piastre, o altri sistemi, previo congelamento.
Voci correlate
Genetica Mendeliana: Genotipo, fenotipo, linea pura, dominanza.
Struttura e funzione del cromosoma: Telomero, centromero, cromatina, cromosomi sessuali.
Struttura e funzione del gene: Gene costitutivo, geni associati, geni omologhi, geni paraloghi.
Ingegneria genetica: Mappatura (mappatura genetica, mappatura fisica), mappatura S1, libreria genomica, libreria di cDNA.
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