Una libreria di cDNA è un insieme di cloni che rispecchiano l'espressione di una cellula, procariotica o eucariotica, in un determinato istante, al seguito dell'estrazione dell'mRNA. In altre parole, attraverso una libreria di cDNA è possibile conservare un profilo di espressione di un tipo cellulare per gli scopi più differenti.

La tecnica di creazione di una libreria di cDNA è diversa rispetto a quella adoperata per una normale libreria di DNA poiché prevede alcuni passi aggiuntivi. È da notare che, generalmente, una libreria di cDNA presenta un minor numero di basi, poiché l'espressione di una cellula, attraverso la trascrizione, coinvolge quasi sempre una piccola parte del DNA. Negli eucarioti e nei procarioti, ad esempio, alcuni geni possono trovarsi in uno stato silenziato, negli eucarioti è, inoltre, frequente l'accorciamento dell'informazione presente nel DNA ad opera di un meccanismo di splicing che elimina alcune sequenze, definite introni, dal DNA.

Estrazione dell'mRNA

Il primo passo, necessario per la costruzione di una libreria di cDNA è rappresentato dalla purificazione dell'mRNA. Questo processo avviene, generalmente, mediante cromatografia, ed è favorito negli eucarioti dalla presenza - a livello dell'mRNA - della coda di Poli-A che viene inserita nel processo di poliadenilazione in 3'. La presenza di un lungo frammento, formato da ripetizioni del nucleotide adenosina può essere agganciata da una sonda sintetica formata dalla timidina all'interno del sistema cromatografico. L'aggancio che determina l'oligo-dT sugli mRNA permette di far scivolare tutto ciò che non interessa alla costruzione della libreria di cDNA.

Sintesi del cDNA

Per la sintesi del cDNA interviene un enzima capace di sintetizzare DNA a partire dal DNA: la trascrittasi inversa. Le molecole di mRNA purificate sono miscelate con un primer oligo-dT che è capace di ibridizzare l'estremità poliadenilata. La transcrittasi inversa procede e sintetizza, in direzione 5' → 3' il frammento di DNA complementare, che viene successivamente allontanato da un buffer alcalino o da un sistema enzimatico.

A questo punto, con la presenza di un cDNA a singolo filamento (sscDNA), è necessario che una DNA polimerasi DNA-dipendente catalizzi la sintesi del secondo filamento. Uno tra questi metodi prevede l'utilizzo, in associazione alla DNA polimerasi, di una RNA-asi H; attraverso questo sistema si produce un loop nella catena primaria e pertanto una catena secondaria può essere sintetizzata. Successivamente la catena, ancora lineare per via del loop, è trattata da una nucleasi S1.

Adattatori

La biosintesi di cDNA, partendo da mRNA, produce dei filamenti doppi di DNA complementare, che tuttavia presentano delle estremità piatte. Per rendere i filamenti di cDNA compatibili con il clonaggio si utilizzano degli opportuni adattatori.

Il cDNA ottenuto può essere clonato, proprio come se fosse una libreria normale di cDNA.

Normalizzazione del cDNA

La normalizzazione di una libreria di cDNA è, genericamente, una tecnica mediante la quale si riduce la ridondanza di frammenti di cDNA che derivano da una sovraespressione di mRNA. In altre parole, se una cellula è particolarmente attiva per quanto riguarda l'espressione di un gene è possibile che, riferito alla trascrizione di quel gene, possono essere rilevate numerose molecole di mRNA. La normalizzazione di una libreria di cDNA ha lo scopo di effettuare uno screening e dare una importanza uguale sia ai profili di sovraespressione, sia a quelli di sottoespressione. Se un gene fosse poco espresso sarebbe logico rilevare poche molecole di mRNA relativo a quel gene che potrebbero essere "confuse" o comunque difficilmente rintracciate, all'interno della genoteca di cDNA.

Le tecniche per la normalizzazone del cDNA solo diverse. In alcune si utilizza il cDNA clonato, lo si rende a singola elica, e lo si aggancia in una colonna per cromatografia. L'mRNA viene fatto eluire nella colonna e, statisticamente, la maggior parte degli mRNA sovraespressi rimangono appaiati al cDNA. Questa tecnica, tuttavia, è poco efficace e molto laboriosa. Altri metodi sfruttano la separazione dei filamenti di cDNA e la loro cinetica di riaccoppiamento.

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