La tecnica real time PCR o PCR quantitativa o RTq PCR, è una tecnica di laboratorio attraverso la quale si tipizza una molecola di DNA attraverso la ricerca - mediante una sonda - e la successiva amplificazione di un frammento. La real time PCR è effettuta in modo del tutto simile alla "tradizionale" PCR, con la differenza che, per via dell'utilizzo di marcatori o sonde fluorescenti, è possibile osservare in tempo reale (real time) per ogni ciclo l'eventuale aumento della concentrazione di DNA.

La possibilità di osservare "in fase di lavoro" l'aumento di concentrazione del DNA, e la grande sensibilità della tecnica, delegano la real time PCR a tecnica d'elezione per la ricerca e l'amplificazione del materiale genetico.

Tecnica

Un frammento di DNA, isolato e purificato, è posto in un pozzetto della macchina. All'interno del pozzetto è presenta una miscela di deossioligonucletidi, cofattori e un buffer stabilizzante. Le fasi che avvengono, successivamente all'immisione del campione, sono cicliche e prevedono:

  1. Aumento della temperatura per il disappaiamento della doppia elica;
  2. Inserimento di oligonucleotidi (sonde) che, se presenti, si appaiano alle zone bersaglio del DNA. Opzionalmente, le sonde possono essere addizionate di marcatori a fluorescenza.
  3. Dopo l'appaiamento, la temperatura è portata a circa 72°C e la DNA polimerasi, generalmente la TAQ-polimerasi, aggancia le eventuali sonde e allunga il DNA.

Dopo un numero di cicli, la concentrazione di DNA è sufficientemente alta da poter essere apprezzata attraverso l'analisi a fluorescenza che viene realizzata in modo automatico dalla macchina.

Rilevamento

Il rilevamento può avvenire direttamente se durante i cicli sono state usate delle sonde marcate, oppure indirettamente se viene utilizzato un agente intercalante marcato che, legandosi alla doppia elica, si lega stabilmente ad essa. Il metodo che utilizza le sonde marcate è molto più specifico, ma presenta un costo maggiore.

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