PCR

Il termine PCR è un acronimo di polymerase chain reaction e descrive un protocollo per l'amplificazione, in laboratorio, di un frammento di DNA. La PCR è una tecnica di grande importanza in ogni ambito scientifico; si utilizzano le PCR per esperimenti  zoologici, biologici, diagnostici, legali e per altri campi ancora.

In una serie di reazioni, nelle quali è attivo un solo tipo di enzima polimerasico, un piccolo frammento di DNA, se presente nella soluzione da amplificare, è individuato e amplificato La PCR è condotta in dei piccoli pozzetti inseriti in un macchinario chiamato termociclatore.

Realizzazione della PCR

Il primo passo per l'amplificazione di un segmento di DNA è quello di rompere la doppia elica. Per questa ragione, il macchinario provvede all'aumento della temperatura all'interno del pozzetto fino al raggiungimento di circa 94-96°C per 15 secondi.

 Schema della PCR

Schema esemplificativo della PCR

Dopo il disappaiamento del DNA si inseriscono i primer, in altre parole molecole di DNA complementari, che si appaieranno alle doppie eliche in specifiche regioni. A questo punto, è chiaro che se i primer sono specifici per una sequenza e questa manca nel DNA l'esito della PCR sarà negativo. I primer non sono casuali ma vengono scelti in base alla zona del DNA che si intende amplificare.

Per illustrare, in dettaglio, il funzionamento della PCR si possono prendere come esempio due casi: una indagine di infezione da virus HPV (e relativo ceppo) ed un test per determinare se una persona è affetta da una malattia che si manifesta a causa di una alterazione genetica. Nel primo caso si utilizza un primer complementare ad una sequenza tipica del virus HPV e, se questa sequenza venisse rilevata, è possibile procedere alla tipizzazione con una seconda analisi utilizzando un primer specifico per il ceppo. Nel secondo caso si utilizza un primer che si appaia alla sequenza alterata del DNA. È importante comprendere che i primer devono essere lunghi non meno di 16 paia di basi; se fossero più corti, specialmente in molecole di DNA lunghe, potrebbero appaiarsi in luoghi di non interesse e generare falsi positivi.

Dopo l'appaiamento del primer al DNA la temperatura è  abbassata a circa 72°C. A questo livello il DNA rimane a singolo filamento e interviene una particolare DNA polimerasi indicata con l'acronimo di TAQ (da Termophylus acquaticus). L'enzima in questione possiede il proprio optimum di lavoro proprio nel range di temperatura che va dai 70°C ai 75°C poiché il batterio dal quale è estratto è solito vivere in ambienti estremamente caldi. La polimerasi inizia ad allungare, partendo dal primer, in direzione 5'→3'. Per ovvi motivi il pozzetto, oltre al DNA, deve contenere deossinucleotidi trifosfato che serviranno proprio per allungare il DNA. Inoltre deve contenere un tampone formato da Tris, KCl e MgCl.

Enzimi della PCR

Enzima

Provenienza

Emivita

Taq

Thermus aquaticus

40 minuti

Pfu

Pyrococcus furiosus

 

Tma

Thermotoga marittima

50

Vari tipi di polimerasi utilizzate nella PCR.

A fine reazione, in un primo ciclo, da due filamenti di DNA se ne sono ottenuti quattro. Procedendo con le reazioni è possibile amplificare esponenzialmente il numero di filamenti di DNA. Per apprezzare il lavoro della PCR è necessario prendere un piccolo campione dal pozzetto di riferimento e analizzarlo mediante elettroforesi. La rivelazione, ad opera del bromuro di etidio, dimostra se il frammento del DNA di interesse era presente prima della reazione oppure meno.

Fasi e resa della PCR

La resa di una generica reazione PCR può essere schematizzata in un grafico che tiene conto della concentrazione del DNA (in valore logaritmico) rispetto al numero dei cicli.

Fasi della PCR

Fasi della PCR.

La prima fase è definita fase geometrica e rappresenta tutti gli eventi che seguono i primi cicli di appaiamento ed estensione nella PCR. La seconda fase è definita lineare, poiché procede con un andamento lineare - se osservato in scala logaritmica -. L'ultima fase prende il nome di plateau poiché si assiste all'assestamento del sistema e al blocco dell'allungamento e della "duplicazion" del DNA.

Le ragioni dell'entrata nella fase di plateau sono diverse e possono riguardare sia un deperimento dell'enzima, ad esempio dovuto all'esposizione al calore, sia la mancanza di primers o di nucleotidi.

Scelta dei primers

La scelta dei primers, nella PCR, è un passo di fondamentale importanza. Innanzitutto il primer deve essere significativo, e quindi deve rispecchiare la sequenza, già nota, del target. Inoltr, deve essere adeguatamente misurato per evitare legami aspecifici, nel caso fosse troppo corto, oppure ripiegamenti a forcina nel caso fosse troppo lungo.

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