Sequenziamento del DNA

Il sequenziamento del DNA è una operazione di laboratorio che serve a restituire l'esatta sequenza dei nucleotidi che compongono una catena di DNA. Attraverso il sequenziamento è possibile ottenere le informazioni sulla "struttura primaria" della catena.

Esistono differenti tipi di sequenziamento, e altrettante variazioni che permettono di modulare sia le sensibilità del metodo sia la velocità. Attualmente, i moderni laboratori adottano il cosiddetto sequenziamento enzimatico poiché rappresenta un compromesso tra facilità di esecuzione e difficoltà nell'applicazione del protocollo.

Il sequenziamento del DNA è una operazione molto diversa dalla mappatura, sia per i metodi utilizzati sia per le finalità, poiché la mappatura serve esclusivamente a stabilire la distanza tra due o più geni in un filamento di DNA o, genericamente, in un cromosoma.

Sequenziamento chimico

Il sequenziamento chimico o sequenziamento di Maxam-Gilbert è un protocollo di sequenziamento adatto per l'analisi di piccoli genomi. Gli step necessari sono pochi e, nello specifico, sono i seguenti:

  1. Purificazione del DNA da estrarre;
  2. Denaturazione del DNA e conseguente rottura dei legami elica-elica;
  3. Marcatura delle estremità 5' del DNA con 32P;
  4. Il DNA trattato viene posto in 4 recipienti separati che contengono, ciascuono di essi, delle molecole capaci di rompere selettivamente il DNA a livello dei nucleotidi. La concentrazione di queste molecole è molto bassa, cosicché la rottura avviene casualmente e idealmente una volta per singolo filamento di DNA. Un recipiente contiene dimetilsolfato (DMS) e piperidina che rompono la sequenza a livello della guanosina, un secondo recipiente contiene dimetilsolfato, acido formico e pieperidina e rompe la sequenza a livello della guanosina e dell'adenosina, un terzo recipiente contiene idrazina e piperidina e media la rottura a livello della timosina mentre l'ultimo recipiente contiene idrazina, piperidina e un buffer di cloruro di sodio e rompe la catena in prossimità della citosina.
  5. La rottura casuale porta alla formazione si segmenti, di lunghezza differente, di DNA. Il segmento di interesse è marcato con il 32P e, per questa ragione, può essere visualizzato dopo una elettroforesi mediante l'autoradiografia.

La lettura delle bande marcate è compiuta da un operatore che può stabilire la sequenza del frammento di DNA semplicemente scorrendo le bande. Questa tecnica pur presentando dei vantaggi, è molto costosa e prevede l'utilizzo di sostanze cancerogene. Inoltre, è adatta per genomi di piccole dimensioni ma diventa molto laboriosa e costosa per genomi grandi. Per queste ragioni, non è molto praticata.

Sequenziamento Sanger

Il sequenziamento Sanger, detto anche a terminazione di catena è un metodo di sequenziamento molto diffuso, relativamente veloce e dal minor rischio per l'operatore. Prevede l'analisi della sequenza a seguito di un tipo di PCR modificata e di una reazione con una DNA polimerasi. Per questa ragione, il sequenziamento Sanger è anche definito sequenziamento enzimatico.

La teoria alla base del sequenziamento Sanger prevede l'interruzione della polimerizzazione del DNA mediante l'immissione di dideossinucleotidi marcati, in altre parole nucleotidi che non presentano un ossidrile a livello del C2 e C3 e che, successivamente, possono essere rivelati mediante autoradiografia.

Al pari del sequenziamento di Maxam-Gilbert, avviene in quattro recipienti separati. In ciascuno di essi, oltre ai normali deossinucleotidi fosfato, alla polimerasi, e ai cofattori viene aggiunto un dideossinucleotide e un primer. Il primer si appaia al DNA e serve da "segnale d'inizio" per la reazione di polimerasi. Il dideossinucletide è presente in concentrazione molto bassa così che possa essere integrato nella neonascente catena di DNA in modo assolutamente casuale. La presenza di un dideossinucleotide impedisce l'allungamento della catena e la reazione di polimerasi, per quel singolo filamento, si blocca.

La miscela, che contiene nei quattro recipienti frammenti casuali più o meno lunghi, è sottoposta a elettroforesi e successiva autoradiografia. In questo modo è possibile valutare la sequenza dei nucleotidi.

Pirosequenziamento

Un sequenziamento alternativo è utilizzato per aumentare la velocità di analisi. Il pirosequenziamento è un sistema molto veloce, anche se limitato per la lunghezza di basi che permette di sequenziare una molecola di DNA mediante l'approccio informatico.

In un recipiente viene inserito il DNA amplificato e una aliquota di adenosinsolfofosfato e luciferina. Nel recipiente vengono posti anche egli enzimi: una luciferasi, una apirasi, una ATP solforilasi e ovviamenta una DNA polimerasi. In modo automatico viene inserito un singolo nucleotide alla volta e se questo è necessario per l'avanzamento della DNA polimerasi viene inserito. L'aggiunta del nucleotide libera il pirofosfato che, mediante l'azione dell'ATP solforilasi converte l'adenosinsolfofosfato in ATP. L'ATP è attiva la luciferasi che emette, immediatamente un lampo rilevato da un apposito detector. Per quanto riguarda in nucleotide adenosina non è direttamente inserito l'ATP, che reagirebbe immediatamente con la luciferasi ma un altro nucleotide modificato che viene riconosciuto dalla polimerasi ma non dalla luciferasi.

Se il nucleotide non dovesse per la progressione della neonascente catena, allora viene immediatamente degradato dall'apirasi.

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